近日,中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所王方軍研究員團(tuán)隊(duì)與中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)黃光明教授團(tuán)隊(duì)合作,利用大連相干光源發(fā)展了胞內(nèi)蛋白極紫外激光解離Top-Down質(zhì)譜表征(UVPD-TDMS)新方法,為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)原位質(zhì)譜表征和變體構(gòu)象異質(zhì)性解析提供了創(chuàng)新性分析技術(shù)。
細(xì)胞內(nèi)柔性蛋白質(zhì)通常同時(shí)存在多種構(gòu)象,不同構(gòu)象具有差異化的配體結(jié)合能力,生物體通過(guò)調(diào)節(jié)不同構(gòu)象的分布占比來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的精細(xì)調(diào)控。然而,胞內(nèi)蛋白的結(jié)構(gòu)和活性表征大多采用純化蛋白在體外完成,難以避免純化過(guò)程和緩沖溶液對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象所產(chǎn)生的影響。
本工作中,研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)誘導(dǎo)電噴霧離子化裝置,成功實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)鈣調(diào)蛋白的原位離子化及質(zhì)譜直接檢測(cè)。分析發(fā)現(xiàn),胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白存在三種主要的共存構(gòu)象,與純化蛋白相比具有更高豐度的伸展構(gòu)象。進(jìn)一步,團(tuán)隊(duì)采用UVPD-TDMS技術(shù)解析了不同Ca2+結(jié)合變體構(gòu)象的結(jié)合形式和結(jié)構(gòu)特征,發(fā)現(xiàn)Ca2+結(jié)合能力受構(gòu)象調(diào)控,緊湊構(gòu)象比伸展構(gòu)象具有更高的Ca2+結(jié)合能力;同時(shí)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)偏好性也受構(gòu)象調(diào)控,伸展構(gòu)象中Ca2+更傾向于結(jié)合EF-3和EF-4區(qū)域,而緊湊構(gòu)象中則傾向于結(jié)合EF-2和EF-3。本工作提出了胞內(nèi)蛋白原位TDMS表征新概念,通過(guò)對(duì)質(zhì)量和電荷分布的精確選擇實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)蛋白變體和構(gòu)象特異性的UVPD-TDMS分析,并展示了a-, x-, c-, z-光解離特征碎片在表征變體構(gòu)象異質(zhì)性方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

近年來(lái),王方軍團(tuán)隊(duì)致力于基于大連相干光源研發(fā)的極紫外激光解離質(zhì)譜新儀器研制和原位化學(xué)標(biāo)記-結(jié)構(gòu)質(zhì)譜新方法研究,在蛋白-蛋白、蛋白-藥物、蛋白-納米材料等非共價(jià)作用位點(diǎn)表征方面取得了系列進(jìn)展(J. Am. Chem. Soc., 2024;Chem. Sci.,2024;Nat Protoc.,2023;J. Am. Chem. Soc.,2023;J. Am. Chem. Soc.,2023;Cell Chem. Biol.,2022;CCS Chem.,2022;Anal. Chem.,2022)。
相關(guān)研究成果以“In-Cell Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation Navigates the Intracellular Protein Heterogeneity”為題,于近日發(fā)表在《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》(Journal of the American Chemical Society)上。上述工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所創(chuàng)新基金等項(xiàng)目的資助。(文/圖 轉(zhuǎn)自中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所所主頁(yè))